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阅读次数 ：16063 发布时间：2016/4/27 21:18:03
一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒 70μl 内切酶（SacI ， SalI ， BglⅡ） 2μl 10 x buffer 8μl 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙醇回收酶切质粒 1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2） ，混匀 ，沉淀DNA； 2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清； 3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟 ，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）； 4）37℃烘干水分和残留乙醇 ； 5）用20μl ddH2O重溶 ； 6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量 ； 三．电转化1．准备感受态细胞 1）5ml YPD 接种GS115单菌落 ，250rpm ，300C ，摇菌24 hours； 2）100ml YPD，接种百分，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm ，7～8hours ，直到OD600＝1.3～1.5 ； 3）菌液转入500ml离心管 ，JA14，1500g，40C离心5 min ，弃上清； 4）100ml冰水重悬，同上离心 ，弃上清； 5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清； 6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。
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