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阅读次数：15955 发布时间 ：2016/12/26 13:49:44
5357cc拉斯维加斯首页入口生物：基质金属蛋白酶MMP2/MMP9明胶酶谱法试剂盒的使用注意事项!注意事项：
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。
2.明胶酶谱的活性受钙离子 ，锌离子，和PH值等因素的影响 ，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值 ，在普通孵箱即可。
操作步骤 ：
1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶 。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟 。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍 ，混匀后加入过硫酸铵和TEMED ，等待凝胶聚合 。
2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue) ，混合后直接上样 。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液 。可通过预试验确定加样量 ，使用普通蛋白预染Marker 即可。
阳性对照(可选步骤)：可取人 、小鼠 、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样 。
注 ：因为全血成分复杂,MMP活性较低，的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照
3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液 。
5 孵育：倒掉Buffer A 。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释) ，室温或37ºC 孵育1~5 小时 。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示 。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。
6 显色 ：倒掉Buffer B ，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域 。
透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2) 、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带 。
7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示 ，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中*常见的格式。
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