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一氧化氮合酶染色液的方法

阅读次数 :16024    发布时间:2019/5/13 10:27:15

   一氧化氮合酶(NOS)是一种同工酶 ,分别存在于内皮细胞、巨噬细胞 、神经吞噬细胞及神经细胞中 。一氧化氮合酶存在于神经元中 ,在不同脑区呈选择性分布。因为一氧化氮很不稳定,因而研究生成一氧化氮的酶似乎更容易些 ,特别是一氧化氮合酶拮抗剂的发现 ,大大促进了一些一氧化氮功能的研究 。
     NO极不稳定 。易于扩散游离,半衰期短,不易检测 。因NOS是合成NO的关键酶,故通常通过检测NOS的活性来评估NO的分布和功能。
     NOS有3种异构型,即神经型NOS(neuronal NOS ,nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS。eNOS)和细胞因子诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)。由于还原型辅酶Ⅱ―黄递酶(NADPH-d)与NOS在化学结构和组织定位上有极高的一致性 ,且也与NO生成密切相关.故人们常采用NADPH-黄递酶法来显示NOS活性。

1.原理  在βNADPH存在下,NOS的C末端能将NADPH电子转移到NBT,将NBT还原成不溶性蓝紫色甲腊沉淀产物。

2.孵育液配制

β―NADPH 10mg

NBT 5mg

Triton X―100 0.03ml

0.05mol/L TB(pH 8.0) 9.97ml

临用前配制 。

3.染色程序

(1)固定:4%多聚甲醛(0.1mol/LPBS配制)灌流固定 ,取材后入同样固定液再固定1小时(4℃),20%蔗糖中4℃过夜;

(2)冰冻切片:厚10―401.Lm ;

(3)孵育:切片人孵育液中37%孵育30分钟~1小时;

(4)终止反应 :切片人0.05mol/LTB或蒸馏水中;分钟 ;

(5)常规脱水、透明、封片或直接用甘油明胶封片 。

4.结果与评价 反应产物为蓝色或蓝紫色沉淀 。NADPH-黄递酶法显示NOS活性,方法简便经济,应用广泛,但不能区分NOS亚型 。

5.对照实验  在孵育液中除去β―NADPH或用0.1mol/L N―亚硝基精氨酸(NOS抑制剂)预孵育切片1小时 ,结果应为阴性。

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