细胞核蛋白提取试剂盒的操作方法

阅读次数：15899 发布时间：2019/5/21 10:14:43

细胞核蛋白提取试剂盒提供了一种简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提核蛋白的方法。通过浆蛋白抽提试剂使细胞膨胀破裂，释放出胞浆蛋白，再通过离心得到细胞核。然后通过核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
操作方法：

裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

一、对于体外培养细胞：

1．根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入PMSF，使PMSF的*终浓度为1mM。PMSF需现用现加，若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸，可以在两种蛋白抽提液中加入DTT至终浓度0.5mM。

2．对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS洗一遍，用细胞刮刀收集细胞，或用EDTA消化后吹打下细胞（不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。500 g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清留下沉淀备用。

3．对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，500 g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

4．每20μl细胞沉淀加入200μl浆蛋白抽提试剂（2×106个细胞沉淀的体积约20μl或40mg）。

5．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长），必须使细胞沉淀完全分散开成单细胞悬液。细胞沉淀分散不完全会导致蛋白产量降低。

6．冰浴10分钟。

7．转速剧烈涡旋10秒，4℃ 12000～16000g离心10分钟。

8．上清即为抽提得到的细胞浆蛋白，立即吸取上清至预冷的样品管中备用，进行后续的PAGE、Western等实验，但蛋白浓度较低，可根据需要进行相应浓缩。

9．沉淀即为细胞核，要完全吸尽残余的上清（避免细胞浆蛋白的污染），加入50-100μl核蛋白抽提试剂。

10．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长）至沉淀完全分散，冰浴10分钟。

11．转速剧烈涡旋10秒，4℃12000～16000g离心10分钟。12．立即吸取上清至预冷的样品管中，此即为抽提得到的细胞核蛋白。可进行后续实验或-70℃冻存。对于组织样品：把组织称重后，尽可能切成非常细小的碎片，按每50mg组织加入200μl-500μl PBS，用匀浆器冰上匀浆制成细胞悬液，500 g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清，收集沉淀。加入200μl浆蛋白抽提试剂后接上述步骤5。

注意事项：

1．裂解得到的蛋白样品，由于含有较高浓度的去垢剂干扰，不能用Bradford法测定蛋白浓度。

2．对于组织样品，本试剂盒适用于新鲜组织，对冻存组织抽提效果较差。

3．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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