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阅读次数：15922 发布时间 ：2019/12/31 14:17:57
RT-PCR实验操作过程
试验前注意：
1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug 。
2. RT按要求做 ，一般不会出太大问题。
3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在 ，不是单改变Mg2+浓度 、退火温度能解决的 。
试验过程：
实验器具：
1 、 移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl 、2μl
2 、 吸头 ：1ml、200μl、20μl
3 、 匀浆管 ：5ml
4 、 吸头台 ：放置1ml吸头的一个 ，放置20μl吸头的一个
5、 EP管：1.5ml 、0.2ml 、100μl
6、 试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶(广口，带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇
7、 量筒：50ml、250ml 、500ml
8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、 试管架：5ml、1.5ml、20μl
10 、 盐水瓶 ：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇 ，另一个装DEPC水
11 、 铝制饭盒：4个
12、 塑料小饭盒：1个
13 、 大瓷缸：2个
14、 锡泊纸：一卷
15 、 卷纸：2卷
16、 三角烧瓶：带盖，稍大
实验器具的处理与准备 ：
1 、 塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中 ，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用 ，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)。
2 、 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干)。
3、 匀浆器：(包括剪刀 、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC
试验试剂 ：
1 、 DEPC水 ：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2 、 75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)。
3、 异丙醇 ：放入棕色瓶中。
4、 氯仿：放入棕色瓶中 。
5 、 琼脂糖
几种缓冲液的配制：
1 、 电泳缓冲液： Tris? ?54g??硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml。
2、 5×TBE (贮存液)再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度) ，如取50ml贮存液加入450ml水——→500ml工作缓冲液。
3 、 上样缓冲液 ：0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液 ，4℃保存。
RT-PCR实验操作过程
原创作者 ：南京5357cc拉斯维加斯首页入口生物技术有限公司
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