脱氢抗坏血酸(DHA)检测试剂盒(菲咯啉微板法)的操作步骤

阅读次数：15442 发布时间：2023/12/20 15:29:35

脱氢抗坏血酸(DHA)检测试剂盒(菲咯啉微板法)的操作步骤

产品简介：

维生素 C(Vitamin C)又称 L-抗坏血酸(AsA)，是高等灵长类动物与其他少数生物的必需营养素，在生物体内维生素 C 是一种抗氧化剂，为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸内酯，保护身体免于自由基的威胁，同时也是一种辅酶，其广泛的食物来源为各类新鲜蔬果。Vc有 L-型和 D-型两种异构体，只有 L-型的才具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活性。

脱氢抗坏血酸(DHA)检测试剂盒(菲咯啉微板法)检测原理是利用还原剂将脱氢抗坏血酸还原成还原型抗坏血酸，在酸性条件下维生素 C(抗坏血酸)把三价铁离子还原成亚铁离子，后者与菲咯啉形成稳定的红色螯合物，以酶标仪 534nm 处检测吸光度，在一定浓度范围(样品浓度控制在 10~250μg/ml)吸光度与抗坏血酸含量呈线性关系，获得抗坏血酸含量。该试剂盒主要用于植物组织中的维生素 C(抗坏血酸)的检测，计算出总抗坏血酸含量，从中减去样品中原有的还原型抗坏血酸含量，即得脱氢抗坏血酸含量。优点是：1、反应稳定，不易褪色；2、操作简便；3、还原糖及其他常见的还原物质对实验没有干扰，因此专一性好；4、灵敏度高。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

操作步骤(仅供参考)：

1、稀释组织匀浆液：按组织匀浆液(5×)：蒸馏水=1：4 的比例稀释，获得 1×组织匀浆液，待用。

2、制备 AsA 提取液：取待测材料如青菜、水果、松针等，清洗擦干，准确称量 2.5g，加入研磨器内，再加入少量 1×组织匀浆液，研磨碎，留取上清，再次用 1×组织匀浆液研磨，一并倒入 50ml 离心管，补充 1×组织匀浆液至 22.5ml，充分混匀，4000g 离心 5min，留取上清液即为 AsA 提取液。

3、制备 DHA 待测液：取 4ml AsA 提取液，加入 2ml DHA 还原液，用 NaOH 溶液调节pH 至 7~8，室温下静置 10min，使脱氢抗坏血酸还原成抗坏血酸，再加入 1.6ml 组织匀浆液(5×)和 0.4ml 蒸馏水即为 DHA 待测液。

4、配制系列抗坏血酸标准：取干净的 96 孔板，按下表进行操作，依次稀释。

5、DHA 加样：按照下表设置空白孔、标准孔、AsA 测定孔、DHA 测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的抗坏血酸含量过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测能设置 2 平行孔，求平均值。

6、DHA 测定：立即混匀，以空白调零，酶标仪测定 534nm 处系列标准孔、AsA 测定孔、DHA 测定孔的吸光度。

计算：以系列标准抗坏血酸(5、10、20、30、40、50μg)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。以 AsA 测定孔吸光度代入回归方程求得 AsA 提取液中 AsA 含量；以 DHA 测定孔吸光度代入回归方程求得 DHA 待测液中总 AsA 含量；总 AsA 含量与 AsA 提取液中 AsA 含量的差值即为脱氢抗坏血酸(DHA)含量。

DHA 含量(mg/100g)=(m0×VT×100)/(m1×VS×1000)

式中：m0=总 AsA 含量与 AsA 提取液中 AsA 含量的差值(μg)

VT=待测液的总体积(ml)

m1=样品质量(g)

VS=测定时取样体积(ml)

100=100g

注意事项：

1、上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2、组织匀浆液(5×)久置或低温保存，容易产生乳白色浑浊；如果白色浑浊不明显，可以直

接使用，不影响效果；如果白色浑浊较多，应弃用。

3、待测样品如不能及时测定，应置于 2~8℃保存，3 天内稳定。

4、如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。